
彗星實驗(Comet assay)又稱單細胞凝膠電泳實驗,是在單細胞水平檢測有核細胞DNA斷裂的技術。細胞受到氧化應激、輻射、化學物質等損傷因子作用時,DNA鏈會發生斷裂,形成大小不一的片段。在堿性條件下,DNA雙鏈解旋,斷裂的DNA片段從核中釋放出來,在電場作用下向陽極遷移,形成彗星形態。DNA受損越嚴重,遷移的DNA量越多,遷移距離越長。通過測定遷移部分的長度可定量測定單個細胞DNA損傷程度。
實驗過程:
1. 準備細胞;
2. 第一層凝膠德制備:在載玻片上,1%正常熔點瓊脂糖凝膠的制備,加蓋玻片,4℃放置大于10min使其凝固;
3. 第二層凝膠的制備:10ul細胞(104個)和75ul的0.7%低熔點瓊脂糖混合均勻,滴加到第一層凝膠上,4℃放置大于10min;
4. 在4℃細胞裂解過夜;
5. 將載玻片放入水平電泳槽中,倒入4℃預冷的電泳緩沖液,室溫放置60min;
6. 電泳電壓設定為20V,時間20min;
7. 電泳后將載玻片置于平皿內,加入中性緩沖液,4℃中和1-3次,每次10min;
8. 在載玻片上滴加20ulPI溶液,避光染色10min ,超純水洗滌3次,蓋上蓋玻片;
9. 實驗結果。
